環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B Epoxy activated Sepharose 6B使用說明書

環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B
品牌: 金畔生物
英文名稱: Epoxy activated Sepharose 6B
說明:分離試劑
產(chǎn)品簡介
環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B以6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用環(huán)氧活化的方法激活瓊脂糖上的羥基,活化后即可直接用于各種配基的偶聯(lián)。可用于各種含有氨基、巰基或羥基的親和配基(蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸或糖等)的偶聯(lián)。具有使用方便、偶聯(lián)條件溫和、偶聯(lián)效率高和應(yīng)用范圍廣的特點。
GRADE: BR
基質(zhì): 6%高度交聯(lián)瓊脂糖凝膠
功能基團: epoxy
配基密度: 20-40umoles/mL drained matrix
平均粒徑: 90um
最大流速: 300cm/h
偶聯(lián)條件: pH8-10,溫度 4 45°C時間1-16小時，可在水相和有機相中偶聯(lián)
用途:親和層析介質(zhì)
性狀:白色膠體;
儲存溫度: 4-8°C
使用說明:
1、溶液的準備
偶聯(lián)液:0.1M Na2CO3, pH8. 5-10.0
封閉液: 1M乙醇胺, pH8.0
清洗液1: 0.1M 乙酸~乙酸鈉，0.5M NaCI, pH4.0
清洗液2: 0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCI, pH8.0
保護液:含20%乙醇的1XPBS
2、樣品準備
樣品用偶聯(lián)液溶解，濃度約5-10mg/ml。
3、樣品偶聯(lián)
1)取適量的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B,去除保護液，離子水清洗三次，用偶聯(lián)液清
洗一次。
2)將溶解好的樣品中溶解后轉(zhuǎn)入清洗好的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B中填料:樣品.
溶液體積比約為1:1。
3) 25- 40°C搖床中振蕩混合反應(yīng)24h。注:確保樹脂懸浮起來,否則會大大影響偶聯(lián)效率。
4)反應(yīng)完后收集偶聯(lián)樣品，以便檢測偶聯(lián)效率。偶聯(lián)液清洗一遍。
5)加入等體積的封閉液，37 度振蕩混合反應(yīng)1h。
6)將上述反應(yīng)體系取出，流干其中的溶液，用3倍柱體積的去離子水清洗樹脂，清洗液1、去離子水、清洗液2和去離子水
重復(fù)沖洗2次,然后保存在等體積的保護液中，于29C-89C保存。
注意事項:
1.不同配基的偶聯(lián)方法與上面類似，但是反應(yīng)的條件例如:配基加入量,反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度應(yīng)根據(jù)配基的不同進行適當?shù)?br /> 調(diào)整
2.可用碳酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽緩沖液做為偶聯(lián)緩沖液,但絕對不能使用含有氨基的Tris、甘氨酸的緩沖液。

下面簡要介紹環(huán)氧活化瓊脂糖微球偶聯(lián)含氨基配基的使用過程

環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF 是將環(huán)氧基團鍵合在瓊脂糖微球 6FF 上凍干形成的一種活性中間體，可直接偶聯(lián)含氨基、巰基和羥基的配基制備分離介質(zhì)，用于生物大分子的純化分離。

• 干粉的溶脹（非干粉形態(tài)忽略此步驟）

稱取一定量的環(huán)氧活化高流速瓊脂糖微球凍干粉，在蒸餾水中懸浮溶脹（1g 干粉約溶脹為 3～4ml?凝膠），放置大約 1?小時后抽濾，并用約 200ml（PH?7）去離子水洗滌干凈其中的添加劑，并在漏斗中抽干。

• 配基的偶聯(lián)

一般配基偶聯(lián)的過程如下：

• 偶聯(lián)溶劑：可用去離子水、碳酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液。不能用含氨基和其他含親核試劑的溶液。有時需要有機溶劑溶解配基，如用 50%二甲基甲酰胺和二氧六環(huán)等。
• 取一定量的配基溶解到偶聯(lián)用的緩沖溶液中，使其完全溶解，最低濃度為200μmol

配基/ml?凝膠。凝膠與緩沖溶液以?1：0.5?到?1：1?的比例混合懸浮反應(yīng)。

• 將溶脹的凝膠懸浮到含有配基的緩沖溶液中，在20℃~45℃的水浴中搖蕩?16?小時。也可以用其他攪拌方法使配基偶聯(lián)，請勿用磁力攪拌。
• 反應(yīng)完全后，再洗滌掉緩沖液中的多余的配基。
• 殘余活性基團的消除，將反應(yīng)完洗滌過的凝膠懸浮到 1mol/L乙醇胺（PH?8）的溶液中，在 40℃~50℃最少反應(yīng) 4 小時或者室溫反應(yīng)過夜。
• 在反應(yīng)完后，用含有 5mol/LNaCl 的 0.1mol/L 醋酸緩沖液（PH 4.0）和含有 0.5mol/LNaCl 的偶聯(lián)緩沖液（PH 8.3）交替洗滌，至少重復(fù)以上循環(huán)洗滌 3 次。

• 裝柱

⑴讓所有的材料和試劑達到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。

⑵根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠，清洗掉溶液，抽干，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液

=3：1??的比例）配成勻漿。勻漿作脫氣處理。

⑶將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液位（液面略高于濾膜），務(wù)必使底端無氣泡。

⑷用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開柱子出液口，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，連結(jié)好柱子頂端柱頭。

⑸打開蠕動泵，讓緩沖液用使用時流速的 1.33?倍的流速流過，使柱床穩(wěn)定。用 2~3?倍柱體積的緩沖液平衡柱子。

• 平衡

讓平衡緩沖液以一定流速流過柱子，到流出液電導(dǎo)和?pH?不變。平衡緩沖液一般是根據(jù)需要純化的蛋白來決定用哪種緩沖液。

• 上樣

⑴樣品用平衡液配制，渾濁的樣品要離心和過濾后上樣。

⑵一般情況是讓目標產(chǎn)品結(jié)合在柱子上，用平衡液洗去雜質(zhì)，再選擇一種洗脫液洗下目標產(chǎn)品。

⑶介質(zhì)對樣品組分吸附的程度取決于介質(zhì)配基的親和作用、樣品的親和性質(zhì)、流動相的組成和溫度。

(4)再用緩沖液平衡到流出液電導(dǎo)和?pH?不變。

• 洗脫

洗脫液也要根據(jù)需要純化的蛋白決定。

• 再生

對于使用之后的凝膠，以 2~3?倍柱體積的 0.1mol/L?Tris·HCl+0.5mol/L?NaC（l?PH=8.5）

和?0.1mol/L?NaAc+0.5mol/L?NaCl（PH=4.5）依次反復(fù)沖洗?3~4?次，進行再生。

• 在位清洗

根據(jù)偶聯(lián)的配基選擇在位清洗的方法，以洗去柱子污染物同時不傷害柱子為原則。對于一般的污染，用?0.1mol/L?NaOH?進行較長時間的清洗，對配基基本沒有的影響；當嚴重污染后，可用?0.5mol/L?NaOH??進行短時間的清洗；對于介質(zhì)中含有其他試劑的，可用含有?8?mol/L尿素和?6?mol/L??的鹽酸胍的溶液進行在位清洗。若有失活蛋白或脂類物質(zhì)洗不干凈，可用非離子表面活性劑如?0.1%?Triton?洗滌。

清洗完畢后，用至少?3?倍緩沖液平衡柱子。

• 注意

在裝柱、使用和保存柱子的時候，要避免柱子流干，氣泡進入。